一次性使用的組件為生物制品的生產(chǎn)帶來了很多優(yōu)勢。它們干凈、買來即用、不需要滅菌，因此也就減少了如沖洗用水系統(tǒng)（WFI）和蒸汽發(fā)生器檢修的需求。一次性的組件不能用于后續(xù)的操作，消除了工藝流程運行之間交叉污染的可能性。因為減少或擯棄了對不銹鋼設(shè)備的需求，也可以避免了設(shè)備組裝的長周期。系統(tǒng)的復(fù)雜度降低，因而所涉及的工程需求也同樣減少。再也無需在位清洗（CIP）或在位滅菌（SIP）操作，以及相關(guān)的管道、閥門、控制器或容器的壓力等級。此外，一次性組件的使用還降低了驗證的復(fù)雜度。因為幾乎沒有可反復(fù)使用的組件，也就沒有什么項目需要跟蹤，也就節(jié)省了大量的滅菌、清潔驗證研究。zui后，通過消除了堅固的管道系統(tǒng)和固定發(fā)酵罐的限制，一次性組件還有利于實現(xiàn)更快速的改裝以便用于新流程的運行。一次性組件的使用可在勞力、設(shè)備、廠房設(shè)計以及驗證方面實實在在地節(jié)省可觀的費用。一次性的組件包括：生物處理袋、管、囊式過濾器、切向流艙、生物反應(yīng)器、層析艙及混合系統(tǒng)。
圖1. 波浪生物反應(yīng)器。20/50EH 系統(tǒng)。
一次性生物反應(yīng)器的使用及放大
在某些應(yīng)用中，灌流式細胞培養(yǎng)比分批和補料分批工藝更具優(yōu)勢。操作方式的選擇是根據(jù)工藝規(guī)程所的綜合需求。工藝的優(yōu)化常常是評估哪種類型生產(chǎn)zui有效的*途徑。分批是zui常用的以終點為依據(jù)的生產(chǎn)方式。在分批生產(chǎn)方式中，生物反應(yīng)器在接種、培養(yǎng)并達到的細胞密度和產(chǎn)品濃度的時即收集細胞上清。在補料分批工藝中，在生產(chǎn)流程的晚期進行補加原料以改進細胞活力，增加總的產(chǎn)率。在灌流方式中，原料溶液持續(xù)加入生物反應(yīng)器中，用過的培養(yǎng)基也不斷排出。以灌流方式來運行工藝能增加培養(yǎng)的持久性和細胞密度，反過來又增加了整體的生產(chǎn)率3,4,9。我們的目的蛋白，AZ-IL2B，是一個二聚體融合蛋白，由人IL-2 連接人免疫球蛋白特異針對pIgR 的scFv 區(qū)域而組成6。這個融合蛋白灌流方式的生產(chǎn)。細胞產(chǎn)生的蛋白水平較低，而且AZ-IL2B 很脆弱，特別是在37º C。灌流生產(chǎn)所帶來的生產(chǎn)容量增加，以及縮短了不穩(wěn)定蛋白在反應(yīng)器中停留的時間，都有助于實現(xiàn)更高的產(chǎn)量。本文總結(jié)了Wave Biotech, LLC所生產(chǎn)的一次性生物反應(yīng)器以灌流方式從25 升 工作體積放大至500升 工作體積的生產(chǎn)放大結(jié)果。我們將比較25 升、100 升和500 升 工作體積的三個不同系統(tǒng)。對于每個生物反應(yīng)器的運行都測定了以
下參數(shù)，包括：細胞數(shù)量和活力、產(chǎn)生的蛋白數(shù)量、葡萄糖和乳酸水平。對每個系統(tǒng)間的這些參數(shù)進行了比較，結(jié)果顯示三個不同體積的生物反應(yīng)器是相當?shù)摹?/span>
材料與方法生物反應(yīng)器描述
每個生物反應(yīng)器由一個靈活的、一次性的、預(yù)先滅菌的塑料袋組成， 這個塑料袋稱為細胞袋(Cellbag®)。在操作中，細胞袋放置在搖擺平臺上,充入部分培養(yǎng)基（圖1）。細胞袋的剩余體積則充入了由二氧化碳（CO2）和氧氣（O2）組成的氣體混合物。這些氣體是通過預(yù)留在細胞袋上的無菌過濾入口來添加的?？諝饬魈峁┝搜鯕猓约翱刂?/span>pH和去除二氧化碳所需的氣體交換。廢氣則通過另一個無菌過濾器和背壓控制閥排出。背壓控制閥確保了細胞袋在任何空氣流下總是充滿的。閥門也防止了細胞袋的過度膨脹以及爆炸的可能。填充空氣的頂部空間占據(jù)了細胞袋被填滿時的一半體積.例如，一個充滿時是50 升總體積的細胞袋將包含25升 細胞懸液和25 升 空氣。空氣在培養(yǎng)時持續(xù)地穿過頂部空間。流程中的氣體，如CO2和O2，以可控的方式與空氣混合。液體混勻以及氣體的物質(zhì)傳遞是通過來回搖動細胞袋而實現(xiàn)的。這種搖動在氣相和液相對分界面產(chǎn)生了波動。這些波動大大增加表面積，能提高氣體轉(zhuǎn)移。波浪運動還促進細胞和顆粒離開底部懸浮（防止沉降）以及大面積混勻，同時不會給細胞帶來任何傷害。搖動可以通過設(shè)定搖擺角度和每分鐘的搖動次數(shù)來控制。這些參數(shù)必須根據(jù)細胞袋中的使用體積來確定。細胞袋的溫度可通過加熱器來控制，此加熱器位于設(shè)備的底盤，對細胞袋的底部進行加熱。加熱器是由同樣位于單元的底盤的非插入式的溫度傳感器來調(diào)節(jié)8。另外還設(shè)計了特別的接口，以供無菌加料及樣品的取出，而無需將生物反應(yīng)器置于層流柜中?？捎脽o菌的管道連接器將培養(yǎng)基、緩沖液和葡萄糖儲存液加入系統(tǒng)中。使用的生物反應(yīng)器分別為20/50EH 系統(tǒng)、200 系統(tǒng)和1000 系統(tǒng)（WaveBiotech, LLC）。
細胞解凍與增殖
我們使用了P6A2細胞系，它是一種基于CHO的懸浮克隆，選擇這個細胞株的原因在于其蛋白生產(chǎn)及生長特性俱佳。細胞在120毫升過濾的培養(yǎng)基中解凍，并放置在150毫升的轉(zhuǎn)瓶內(nèi)。細胞在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)擴增，直到有足夠的細胞來接種更大的轉(zhuǎn)瓶，一直至6升。一旦培養(yǎng)物充分擴增，即被轉(zhuǎn)移到細胞袋中接種。轉(zhuǎn)瓶內(nèi)的細胞密度維持在約2×105 細胞/毫升。用于擴增的培養(yǎng)基是帶有添加劑的無血清的IS CHO-V (IrvineScientific)。我們使用了血球計數(shù)器來計算細胞數(shù)量，并利用臺盼藍染料排除分析來確定細胞活力。利用Bioprofile® 300A (Nova Biomedical)來分析細胞培養(yǎng)試劑。pH值是通過細胞袋探頭進行在線測定，或用PHM220 pH計 (Meter Lab)來離線測定。氧氣、二氧化碳、溫度、搖速及搖擺角度是由Wave Bioreactor的控制器來測定并控制的。
細胞袋接種
細胞一般以1×105-4×105 細胞/毫升的密度接種在細胞袋生物反應(yīng)器中。我們曾以更低的密度（如6×104 細胞/毫升）接種細胞，對細胞生長或生產(chǎn)也沒有不良影響。一旦細胞在轉(zhuǎn)瓶中充分擴增，就進行細胞袋生物反應(yīng)器的接種。這可將轉(zhuǎn)瓶的內(nèi)容物直接轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器內(nèi)。在此時，生物反應(yīng)器已經(jīng)充滿了二氧化碳和氧氣，并包含溫暖的培養(yǎng)基 (37° C)。細胞懸浮液由無菌接管連接到細胞袋，然后通過無
菌的端口泵入生物反應(yīng)器中。
生物反應(yīng)器里的增殖
細胞袋中的細胞能達到比轉(zhuǎn)瓶更高的密度。這zui有可能是由于細胞袋內(nèi)溶氧的增加，以及控制pH的能力。在轉(zhuǎn)瓶中， 密度維持在2×105-6×105 細胞/毫升，加入細胞袋后， 細胞的密度增加至8×105-1×106 細胞/毫升，直到在灌流開始后，P6A2細胞克隆的密度可高達3×107 細胞/毫升。
灌流
一旦細胞達到1×106-2×106 細胞/毫升，即可開始灌流。收集用過的培養(yǎng)基，同時以相同速率向生物反應(yīng)器中加入新鮮的培養(yǎng)基、養(yǎng)分、調(diào)控pH的緩沖液。這是由生物反應(yīng)器的以重量為基礎(chǔ)的灌流控制器來直接控制的。在這個細胞密度下每天的體積交換約為總體積的70-75%。只要細胞活力高于50%，反應(yīng)器就持續(xù)灌流。一旦細胞密度達到約2×107 細胞/毫升，控制乳酸及其他毒副產(chǎn)物的累積就變得更加困難，反過來導(dǎo)致pH的控制也非常困難。到此階段，要移除部分細胞從而維持密度在1×107-2×107 細胞/毫升。每天的體積交換提高至約100%，包括培養(yǎng)基、緩沖液及其他添加劑。利用孔徑為0.2μm的中空纖維微孔過濾柱來灌流細胞培養(yǎng)上清。
通過ELISA和Western Blot進行蛋白分析
AZ-IL2B目標蛋白的定量是通過ELISA進行的。細胞培養(yǎng)上清是以一種于檢測和定量AZ-IL2B嵌合體的方法來分析的。細胞培養(yǎng)上清中的AZ-IL2B通過與包被pIgR區(qū)域特異性抗體的微滴定板的結(jié)合而被捕獲，捕獲的AZ-IL2B通過生物素標記的山羊抗人IL-2多克隆抗體（R&DSystems, Inc.）來檢測。鏈親和素-HRP 結(jié)合物（ BD Biosciences,Pharmingen）加入zui后的檢測步驟中。TMB底物溶液加入反應(yīng)中，與
反應(yīng)中存在的酶直接反映并產(chǎn)生顏色變化，這種顏色變化與樣品中AZ-IL2B的量成正比。利用AZ-IL2B標準曲線和質(zhì)量對照來測定細胞培養(yǎng)上清樣品中AZ-IL2B的量。根據(jù)標準的步驟來進行western blot分析7。蛋白通過8-16%的Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠電泳進行大小分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜與一抗——兔抗人白介素-2 的多克隆抗體（ ChemiconInternational, Inc.）及二抗——堿性磷酸酶結(jié)合的驢抗兔IgG 抗體
（Pierce Biotechnology, Inc.）一起孵育。
圖3. 每天葡萄糖和乳酸水平的化學(xué)分析。WVA、WVB 和WVC 生物反應(yīng)器運行的葡萄糖和乳酸水平。
圖4. 每天的蛋白濃度。三個生物反應(yīng)器運行的蛋白水平的比較，以毫克/升表示。蛋白水平通過ELISA 測定。
結(jié)果
生物反應(yīng)器運行WVA、WVB和WVC分別指的是Wave Biotech®的
生物反應(yīng)器20/50EH系統(tǒng)、200系統(tǒng)和1000系統(tǒng)。
細胞計數(shù)與活力
圖2顯示了每種生物反應(yīng)器的細胞生長和密度相當。生物反應(yīng)器運行WVB沒有達到WVA和WVC那么高的細胞密度，但是確實達到了1.2×107 細胞/毫升。這是由于在第8天加入了高濃度的葡萄糖后導(dǎo)致的葡萄糖峰（圖3）。1.2×10在運行生物反應(yīng)器WVA后，我們發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的培養(yǎng)基配方和投料策略無法支持超過2×107 細胞/毫升以上的細胞密度。在細胞密度達到3×107 細胞/毫升后，WVA的培養(yǎng)物的細胞活力和細胞生長顯著下降，并無法恢復(fù)，這可能是由于缺乏營養(yǎng)物，以及毒性物質(zhì)的積累，包括培養(yǎng)物中的高水平乳酸（圖3）5。氧合不是一個問題，因為我們能調(diào)節(jié)向培養(yǎng)物中添加的氧氣量。每個反應(yīng)器運行中的溶氧維持在73-100%。2×10
對于隨后的反應(yīng)器，在細胞密度達到1.5×107 細胞/毫升或更高，乳酸水平達2.2 克/升或更高時就將部分細胞除去。通過去除細胞和調(diào)整每天的灌流量，生物反應(yīng)器運行被延長，收獲了更多的蛋白。WVA需要更長時間才到達灌流密度（1.2×106 細胞/毫升），這可能是由于第6天溫度意外降至25° C。WVA灌流持續(xù)了13天，平均產(chǎn)量為12.5 毫克/升，而WVB灌流持續(xù)了18天，平均為8.3 毫克/升，比WVA多了5天，收獲蛋白也多了6.7克。WVC灌流了16天，平均產(chǎn)量為12.2 毫克/升，比WVA多了3天，收獲蛋白也增加了
16.4克?；盍Φ脑黾蛹吧锓磻?yīng)器運行的延長都能使產(chǎn)量更高。
蛋白產(chǎn)量
圖4比較了每個運行的蛋白濃度。WVA的蛋白濃度（37.5 毫克/升）比WVB（15.46 毫克/升）或WVC（27.91 毫克/升）更高，這是由于更高的細胞密度。每個反應(yīng)器的整體蛋白產(chǎn)量如下：WVA 7.8克，WVB21.4克，WVC 149.2克。蛋白產(chǎn)量與細胞密度緊密關(guān)聯(lián)。這個解釋是合理的，因為存在更多的細胞，自然也有更多的細胞生產(chǎn)蛋白。WVB并沒有達到WVA或WVC那么高的蛋白濃度。這與觀察到的細胞密度更低是一致的。在圖、5b和5c中，每個反應(yīng)器運行的細胞密度與蛋白濃度重疊。蛋白濃度的增加與細胞密度直接相關(guān)。在每個反應(yīng)器運行終止時確定細胞活力的減少，以及蛋白產(chǎn)量的減少。
圖5. 蛋白水平與活細胞密度。細胞密度與蛋白水平的關(guān)聯(lián)。A. 生物反應(yīng)器運行WVA。B. 生物反應(yīng)器運行WVB。C. 生物反應(yīng)器運行WVC。
葡萄糖和乳酸濃度
每個運行中的葡萄糖和乳酸濃度在圖3中顯示。每個運行的水平基本相似，除了第9天WVB的葡萄糖峰。由于每個反應(yīng)器運行持續(xù)，細胞密度不斷增加，葡萄糖被消耗，而乳酸增加。每個運行后期葡萄糖濃度的尖峰是由于當生物反應(yīng)器葡萄糖水平降低至2.0 克/升時，添加了50%的葡萄糖儲存液而引起的。
蛋白分析
AZ-IL2B 作為一個二聚體蛋白，跑膠時分子量在36-50 kDa。圖6(a)是WVD的Western blot，WVD反應(yīng)器的工作體積為10 升（WaveBiotech 20/50EH系統(tǒng)）。圖6(b)是WVC的Western blot，它的工作體積為500升。圖中通過Western blot對第3天到第9天進行了比較，顯示小型反應(yīng)器與大型反應(yīng)器產(chǎn)生的蛋白之間并無區(qū)別。
討論
Wave Biotech的一次性生物反應(yīng)器從25升放大到500升，對細胞
生長或蛋白生產(chǎn)沒有不良影響。其他影響活力和蛋白產(chǎn)量的因素包括高細胞密度、不合適的添加劑濃度，以及溫度波動。不僅每個系統(tǒng)規(guī)格所產(chǎn)生的蛋白水平相似，而且產(chǎn)生的蛋白在Western blot分析和生物活性測試（數(shù)據(jù)未顯示）時也一致。每個系統(tǒng)的細胞生長和倍增時間也是相當?shù)摹Ｆ骄牡鞍诐舛扰c細胞密度直接相關(guān)。每個生物反應(yīng)器的葡萄糖消耗量與乳酸產(chǎn)量是類似的。隨著每個生物反應(yīng)器的運行，葡萄糖水平下降，而乳酸水平上升選擇一次性的生物反應(yīng)器實現(xiàn)了生物反應(yīng)器運行之間的快速轉(zhuǎn)換。生物反應(yīng)器的安裝、接種以及處理都很輕松，因此生物反應(yīng)器運行的終止以及新反應(yīng)器的接種能在同一天內(nèi)完成。10升、25升和100升生物反應(yīng)器能在標準的8小時工作日內(nèi)取下并重新接種。500升細胞袋的清空、填充以及培養(yǎng)基預(yù)熱需要更長的時間，但生物反應(yīng)器也能在2個8小時工作日內(nèi)取下并重新接種。這個過程很簡單：細胞袋清空、凈化并拋棄。新的預(yù)滅菌細胞袋放置在平臺上，并充入二氧化碳和氧氣。添加培養(yǎng)基并加熱，接著進行細胞接種。10升和25升工作體積的生物反應(yīng)器一般從轉(zhuǎn)瓶中接種。100升和500升的生物反應(yīng)器則從小型
的25升反應(yīng)器中接種。系統(tǒng)從25升到500升的放大不僅簡單而且成比例，只需對體積變
化做出調(diào)整。而培養(yǎng)基配方或添加劑則無需改變。細胞系在25升、100升和500升反應(yīng)體系中以相似的方式增殖和生產(chǎn)。
圖6. 兩個生物反應(yīng)器運行的Western blot 分析。A. 生物反應(yīng)器運行WVD 的工作體積為10 升。
B. 生物反應(yīng)器運行WVC 的工作體積為500 升。MWM=分子量標準。
結(jié)論
成功的灌流工藝是在培養(yǎng)物健康與*產(chǎn)量之間達到平衡。適合*的細胞生長和對生長有利的因素可能對生產(chǎn)不利。例如，增加灌流速率以去除毒性物質(zhì)會將產(chǎn)物稀釋到很低的濃度，為下游處理帶來不便，更不用說與灌流增加相關(guān)的商品費用增加。對培養(yǎng)基成分、添加劑以及投料策略的調(diào)整可能會增加灌流的天數(shù)，而不稀釋蛋白的濃度水平。有報道在生物反應(yīng)器運行中采用兩種不同的培養(yǎng)基配方來控制細胞代謝可降低細胞生長，同
時維持其活力，從而延長收獲產(chǎn)物的天數(shù)1。從生物反應(yīng)器中去除細胞也是一個選擇，我們將它加入工藝中來控制細胞密度。這很難頻繁處理，并增加了生物危害的廢料。如果一
種培養(yǎng)基配方能支持早期的快速細胞生長，然后在生產(chǎn)中控制細胞生長，那是的。
一次性的生物反應(yīng)器比反復(fù)使用的生物反應(yīng)器在清洗、滅菌、驗證、安裝和運行之間的轉(zhuǎn)換時間上更具優(yōu)勢。我們證明了25升、100升和500升 工作體積的系統(tǒng)運行在細胞生長、蛋白產(chǎn)量、葡萄糖消耗以及乳酸生產(chǎn)上是相當?shù)摹?/span>
文章來源：BioProcessing™ 雜志
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